1. Phạm vi áp dụng

- Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sử dụng đĩa Compact Dry EC để định lượng nhanh vi khuẩn Escherichia coli (ngoại trừ chủng E. coli O157) và tổng số coliform trong thực phẩm.

- Phụ lục A cung cấp thông tin về kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và kết quả của các phép thử liên phòng thử nghiệm do các tổ chức AOAC [9],[13],[14], NMKL - NordVal [11] và Microval [12] thực hiện.

2. Định nghĩa về vi khuẩn Ecoli

3. Định nghĩa về vi khuẩn Coliform

4. Khuẩn lạc (colony)

5. Nguyên tắc kiểm tra

- Sử dụng đĩa môi trường chuẩn bị sẵn bao gồm môi trường nuôi cấy, chất tạo gel và hai cơ chất enzym tạo màu. Đĩa chứa môi trường được làm ẩm bằng phần mẫu thử đã chuẩn bị, sau đó chất tạo gel sẽ làm môi trường hóa rắn. Ủ môi trường chứa phần mẫu thử ở nhiệt độ 37 ºC ± 1 ºC trong thời gian 24 h ± 2 h.

- E. coli hình thành các khuẩn lạc màu xanh lam hoặc xanh tím và các vi khuẩn coliform khác với E. coli hình thành các khuẩn lạc màu đỏ hoặc hồng.

* CHÚ THÍCH 1: Các vi khuẩn không phải coliform bị ức chế và sẽ không hình thành các khuẩn lạc màu xanh lam, xanh tím, hồng hoặc đỏ điển hình.

* CHÚ THÍCH 2: E. coli O157 không sinh beta-glucuronidase nên không được phát hiện là E. coli trên đĩa Compact Dry EC. E. coli O157 hình thành khuẩn lạc màu đỏ hoặc hồng trên đĩa Compact Dry EC.

6. Môi trường nuôi cấy và dung dịch pha loãng

6.1. Đĩa Compact Dry EC Ecoli Coliform

- Đĩa Compact Dry EC gồm hỗn hợp các chất dinh dưỡng (pepton, kali nitrat, natri clorua và natri pyruvat), đệm phosphat, các chất chọn lọc đối với vi khuẩn Gram dương, chất tạo gel (polysaccharid có nguồn gốc từ thạch) và hai cơ chất enzym tạo màu là 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl-beta-D galactopyranoside (Magenta-GAL) và muối cyclohexylamoni của axit 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic (X-Gluc).

- Kích thước của đĩa là 20 cm2, mặt sau của đĩa có lưới ô vuông 1 cm × 1 cm và 0,5 cm × 0,5 cm để thuận tiện cho việc đếm khuẩn lạc.

- Bảo quản đĩa ở nhiệt độ từ 1 ºC đến 30 ºC.

6.2. Dung dịch muối pepton (MRD)

- Pepton (sản phẩm thủy phân Casein bằng enzym)        1,0g
- Natri clorua (NaCl)                                                                     8,5 g
- Nước                                                                                              1000ml

- Hoà tan các thành phần vào nước đựng trong bình hoặc chai dung tích 1 000 mL bằng cách đun nóng, nếu cần. Khử trùng 15 min bằng nồi hấp áp lực (6.3) ở 121 °C.

- Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,0 ± 0,2 ở nhiệt độ 25 °C, nếu cần.

7. Thiết bị, dụng cụ vật tư tiêu hao chuẩn bị

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau đây:

- Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

- Dụng cụ đo pH, có độ chính xác đến 0,1 đơn vị pH ở nhiệt độ 20ºC đến 25ºC.

- Nồi hấp áp lực, có thể kiểm soát ở nhiệt độ 121 °C.

- Bình định mức, dung tích 1 000 mL.

- Pipet, có thể phân phối thể tích 1 mL.

- Máy trộn Vortex.

- Túi trộn nhu động, có màng lọc, dung tích từ 80 mL đến 400 mL, ví dụ: Stomacher bag.

- Thiết bị đồng hóa mẫu, ví dụ: Stomacher.

- Tủ ấm, có thể duy trì được nhiệt độ 25 °C ± 1 °C.

- Bộ đếm khuẩn lạc.

8. Lấy mẫu

- Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 11923 (ISO/TS 17728) [6]; đối với lấy mẫu bề mặt thân thịt theo TCVN 7925 (ISO 17604) [3], lấy mẫu sữa và sản phẩm sữa theo TCVN 6400 (ISO 707) [1].

- Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

9. Chuẩn bị mẫu thử

9.1. Chuẩn bị phần mẫu thử, theo phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887).

9.2. Chuẩn bị huyền phù mẫu thử

9.2.1. Chuẩn bị huyền phù mẫu thử

- Cân 10 g phần mẫu thử, chính xác đến 0,1 mg, cho vào thiết bị đồng hóa mẫu và thêm 90 mL dung dịch muối pepton (5.2). Trộn bằng thiết bị đồng hóa mẫu trong thời gian 2 min ± 15 s.

- Đối với các mẫu thử dạng bột, cân 10 g phần mẫu thử, chính xác đến 0,1 mg, cho vào túi trộn nhu động và thêm vào 90 mL dung dịch muối pepton được làm ấm trước ở nhiệt độ 45 ºC ± 1 ºC. Xoay và lắc từ từ cho đến khi mẫu hòa tan.

CHÚ THÍCH: Sử dụng túi trộn nhu động có màng lọc để tránh để lại các mảnh nhỏ lên bề mặt môi trường nuôi cấy.

9.2.2. Mẫu thực phẩm dạng lỏng

- Đối với các mẫu thử dạng lỏng, tùy thuộc mức độ nhiễm E. coli và coliform dự kiến, có thể sử dụng trực tiếp phần mẫu thử không pha loãng hoặc tiến hành pha loãng 1 mL phần mẫu thử trong 9 mL dung dịch muối pepton (5.2) hoặc pha loãng tiếp theo nếu số đếm lớn hơn 250 CFU/đĩa 1).

- Trộn bằng máy trộn Vortex.

10.  Cách tiến hành

- Lấy số đĩa Compact Dry EC Ecoli Coliform cần sử dụng. Nếu cần đếm khuẩn lạc ở các độ pha loãng liên tiếp thì sử dụng một bộ bốn đĩa. Ghi nhãn đĩa với thông tin về mẫu thử và độ pha loãng.

- Mở nắp đĩa, dùng pipet lấy 1 mL phần mẫu thử đã chuẩn bị (xem mục 9), cho vào giữa và đậy nắp đĩa. Phần mẫu thử sẽ khuếch tán tự động và đồng đều trên toàn bộ môi trường để chuyển thành dạng gel.

- Cần thao tác cẩn thận để tránh ô nhiễm vi sinh vật.

- Các mẫu có độ nhớt cao, màu đậm hoặc độ pH quá cao hoặc phản ứng với chất chỉ thị oxy hóa khử có thể ảnh hưởng đến kết quả. Đối với các mẫu như vậy, chỉ phân tích sau khi pha loãng mẫu, điều chỉnh pH của mẫu bằng dung dịch đệm hoặc các biện pháp khác.

- Lật ngược đĩa đã đậy nắp và đặt vào tủ ấm, ủ đĩa ở nhiệt độ 37 ºC ± 1 ºC trong thời gian 24 h ± 2 h. Trong thời gian ủ, cần giữ kín nắp đĩa để tránh thất thoát ẩm

- Đếm các khuẩn lạc có màu trong môi trường nuôi cấy, sử dụng bộ đếm khuẩn lạc. Khuẩn lạc E. coli (ngoại trừ chủng E. coli O157) có màu xanh lam hoặc xanh tím, khuẩn lạc của các vi khuẩn coliform khác với E. coli có màu đỏ hoặc màu hồng, do đó tổng số coliform là tổng số khuẩn lạc màu xanh lam, xanh tím, đỏ và hồng. Có thể đặt tấm giấy trắng ở phía dưới đĩa để thuận tiện việc đếm khuẩn lạc. Việc đếm trên đĩa cần được điều chỉnh theo hệ số pha loãng.

- Khi khó đếm khuẩn lạc do có số lượng lớn khuẩn lạc mọc trong môi trường, có thể tính tổng số khuẩn lạc bằng 20 lần số khuẩn lạc trung bình từ các ô đại diện 1 cm × 1 cm hoặc bằng 80 lần số khuẩn lạc trung bình từ các ô đại diện 0,5 cm x 0,5 cm, các ô này được đếm ở bốn góc của đĩa.

- Phạm vi đếm khuẩn lạc là từ 1 CFU/đĩa đến 250 CFU/đĩa. Nếu đĩa đếm có số khuẩn lạc lớn hơn 250 CFU/đĩa thì pha loãng mẫu thử bằng dung dịch pha loãng thích hợp.

11. Tính và biểu thị kết quả

a) Tính tổng số nấm men, nấm mốc có trong mẫu thử, N, theo trung bình số khuẩn lạc từ hai độ pha loãng liên tiếp, áp dụng Công thức (1):
b) Nếu các đĩa không chứa khuẩn lạc nào thì báo cáo kết quả là:
 
c) Nếu số đếm khuẩn lạc trên một đĩa trong khoảng từ 1 CFU/đĩa đến 3 CFU/đĩa thì báo cáo kết quả là:  
d) Nếu số đếm khuẩn lạc trên một đĩa trong khoảng từ 4 CFU/đĩa đến 9 CFU/đĩa thì tính số ước tính NE nấm men, nấm mốc trên gam sản phẩm theo Công thức (2):  

e) Trường hợp chỉ có đĩa chứa dung dịch pha loãng được nuôi cấy cuối cùng có thể đếm và có chứa từ 10 CFU/đĩa đến 150 CFU/đĩa, thì tính số lượng nấm men, nấm mốc có trên gam sản phẩm, N’, áp dụng:
f) Nếu số đếm khuẩn lạc trên một trong các đĩa có tất cả các dung dịch pha loãng đã nuôi cấy, cho số lượng nấm men, nấm mốc lớn hơn 150 CFU/đĩa, thì báo cáo kết quả là:

12. Báo cáo thử nghiệm

Tài liệu chứng nhận tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 13875:2023 của đĩa Compact Dry EC Ecoli Coliform:

/uploads/news/2024_04/tcvn-13875-2023-compact-dry-ec-e.coli-2023.08.25.pdf