- Việc kiểm soát hàm lượng mycotoxin đóng vai trò quan trọng trong đảm bảo an toàn thực phẩm, chất lượng sản phẩm và đáp ứng yêu cầu kiểm nghiệm theo quy định.

- Trong các phương pháp phân tích hiện đại, phân tích mycotoxin bằng HPLC và LC-MS/MS được ứng dụng rộng rãi nhờ khả năng định lượng chính xác, độ nhạy cao và tính chọn lọc tốt. Tuy nhiên, để đạt được kết quả đáng tin cậy, bước chuẩn bị và làm sạch mẫu trước khi đưa vào hệ thống sắc ký là yếu tố không thể bỏ qua.

- Một trong những giải pháp được sử dụng phổ biến là cột ái lực miễn dịch IAC (Immunoaffinity Column). Công nghệ này giúp làm sạch dịch chiết, loại bỏ nhiều thành phần gây nhiễu trong nền mẫu và thu giữ độc tố mục tiêu trước khi phân tích bằng thiết bị sắc ký.

- Vậy quy trình kiểm nghiệm độc tố nấm mốc bằng IAC kết hợp HPLC/LC-MS/MS được thực hiện như thế nào? Cần lưu ý những gì để tối ưu hiệu suất thu hồi và độ tin cậy của kết quả?

1. Vai trò của cột ái lực miễn dịch IAC trong phân tích Mycotoxin

- Cột ái lực miễn dịch IAC là vật liệu làm sạch mẫu sử dụng cơ chế liên kết đặc hiệu giữa kháng thể và chất phân tích mục tiêu. Trong cột, các kháng thể đặc hiệu được cố định trên giá mang rắn, giúp nhận diện và giữ lại độc tố tương ứng khi dịch chiết mẫu đi qua.

- Đối với phân tích mycotoxin, tùy loại độc tố cần kiểm nghiệm, phòng thí nghiệm có thể lựa chọn cột IAC chuyên biệt cho aflatoxin, ochratoxin A, zearalenone, deoxynivalenol (DON), fumonisin hoặc các nhóm độc tố khác theo phạm vi ứng dụng của sản phẩm.

* Tại sao nên sử dụng IAC trước khi phân tích bằng HPLC hoặc LC-MS/MS?

- Thứ nhất, loại bỏ các thành phần gây nhiễu trong nền mẫu. Dịch chiết thực phẩm và thức ăn chăn nuôi có thể chứa chất béo, protein, sắc tố và nhiều hợp chất khác. Những thành phần này có thể ảnh hưởng đến quá trình tách sắc ký hoặc gây hiệu ứng nền khi phân tích bằng khối phổ. IAC giúp giữ lại độc tố mục tiêu và hỗ trợ loại bỏ nhiều thành phần không mong muốn.

- Thứ hai, tăng tính chọn lọc trong quá trình làm sạch mẫu. Nhờ tương tác kháng nguyên – kháng thể, IAC có khả năng giữ lại chất phân tích mục tiêu tốt hơn so với các phương pháp làm sạch không đặc hiệu trong những ứng dụng phù hợp.

- Thứ ba, hỗ trợ cải thiện độ tin cậy của kết quả. Khi quy trình được tối ưu và kiểm soát đúng cách, bước làm sạch bằng IAC có thể giúp giảm nhiễu, cải thiện khả năng nhận diện pic sắc ký và hỗ trợ định lượng mycotoxin chính xác hơn.

- Thứ tư, chuẩn hóa quy trình chuẩn bị mẫu. Sử dụng cột IAC phù hợp giúp phòng thí nghiệm xây dựng quy trình tiền xử lý mẫu có tính lặp lại, thuận tiện cho việc kiểm soát chất lượng và thẩm định phương pháp.

2. Quy trình kiểm nghiệm độc tố nấm mốc bằng IAC kết hợp HPLC/LC-MS/MS

- Quy trình cụ thể phụ thuộc vào loại mycotoxin, nền mẫu, giới hạn định lượng yêu cầu, loại cột IAC và phương pháp sắc ký đã được thẩm định. Tuy nhiên, một quy trình điển hình thường bao gồm các bước sau.

* Bước 1: Lấy mẫu và đồng nhất mẫu

- Mẫu cần được lấy đại diện cho lô sản phẩm, sau đó nghiền, trộn hoặc đồng nhất theo phương pháp phù hợp nhằm đảm bảo tính đồng nhất trước khi cân mẫu phân tích.

- Đối với các nền mẫu không đồng nhất như ngũ cốc, hạt có dầu hoặc thức ăn chăn nuôi, bước đồng nhất mẫu đặc biệt quan trọng vì độc tố nấm mốc có thể phân bố không đều trong toàn bộ lô hàng.

* Bước 2: Chiết xuất Mycotoxin khỏi mẫu

- Cân lượng mẫu theo phương pháp đã lựa chọn, sau đó bổ sung dung môi chiết thích hợp để giải phóng độc tố khỏi nền mẫu.

- Dung môi và tỷ lệ chiết cần được lựa chọn theo từng loại mycotoxin và nền mẫu. Một số quy trình sử dụng nước, methanol hoặc acetonitrile kết hợp với nước theo tỷ lệ xác định.

- Sau khi chiết, mẫu được lắc hoặc đồng nhất, rồi lọc hoặc ly tâm để thu dịch chiết. Nếu cần, dịch chiết tiếp tục được pha loãng hoặc điều chỉnh thành phần dung môi trước khi đưa qua cột IAC.

Lưu ý: Thành phần dung môi, độ pH và tỷ lệ pha loãng phải tương thích với hướng dẫn của nhà sản xuất cột. Dung môi không phù hợp có thể làm giảm khả năng liên kết của kháng thể với độc tố mục tiêu.

* Bước 3: Làm sạch mẫu bằng cột ái lực miễn dịch IAC

- Đây là bước quan trọng trong quy trình phân tích mycotoxin HPLC.

- Dịch chiết đã chuẩn bị được cho đi qua cột IAC với tốc độ dòng phù hợp. Các kháng thể đặc hiệu trong cột sẽ liên kết với mycotoxin mục tiêu, trong khi nhiều thành phần khác của nền mẫu được loại bỏ cùng dịch chảy qua.

- Sau khi nạp mẫu, cột thường được rửa bằng dung dịch phù hợp nhằm loại bỏ các tạp chất còn sót lại. Tiếp theo, độc tố được giải hấp khỏi kháng thể bằng dung môi giải hấp được quy định trong phương pháp, thu lấy dịch giải hấp để phân tích.

- Các thông số cần kiểm soát bao gồm:

• Tốc độ dòng khi nạp mẫu và rửa cột.
• Thể tích và thành phần dung dịch rửa.
• Dung môi giải hấp và thể tích giải hấp.
• Khả năng thu hồi của độc tố mục tiêu.
• Điều kiện bảo quản và hạn sử dụng của cột.

- Cột IAC cần được lựa chọn theo đúng loại độc tố và phạm vi nền mẫu đã được nhà sản xuất xác nhận. Không nên mặc định một loại cột có thể xử lý hiệu quả tất cả các nhóm mycotoxin.

* Bước 4: Chuẩn bị dịch mẫu trước khi phân tích sắc ký

- Dịch giải hấp sau khi thu được có thể cần bay hơi, hoàn nguyên, pha loãng hoặc lọc qua màng lọc phù hợp, tùy theo phương pháp phân tích.

- Mục tiêu của bước này là đưa mẫu về dung môi và thể tích tương thích với hệ thống HPLC hoặc LC-MS/MS, đồng thời hạn chế các thành phần có thể ảnh hưởng đến cột sắc ký và hệ thống phát hiện.

- Đối với LC-MS/MS, cần đặc biệt chú ý đến thành phần dung môi, muối và các hợp chất còn sót lại có thể gây nhiễm bẩn nguồn ion hoặc làm thay đổi đáp ứng tín hiệu.

* Bước 5: Phân tích Mycotoxin bằng HPLC hoặc LC-MS/MS

- Sau khi làm sạch bằng IAC, dịch mẫu được đưa vào hệ thống sắc ký để tách và xác định hàm lượng độc tố.

- Phương pháp HPLC thường được kết hợp với đầu dò huỳnh quang (FLD) hoặc đầu dò phù hợp khác, tùy đặc tính của mycotoxin và phương pháp đã được thẩm định. Một số chất phân tích có thể yêu cầu dẫn xuất hóa trước khi phát hiện bằng huỳnh quang.

- Phương pháp LC-MS/MS kết hợp sắc ký lỏng với khối phổ hai lần, cho phép nhận diện và định lượng chất phân tích dựa trên thời gian lưu và các chuyển tiếp ion đặc trưng. Kỹ thuật này phù hợp với nhiều phương pháp phân tích có yêu cầu cao về độ nhạy và tính chọn lọc, đặc biệt khi cần kiểm tra nhiều độc tố hoặc nhiều nền mẫu.

- Việc lựa chọn HPLC hay LC-MS/MS phụ thuộc vào chất phân tích, giới hạn phát hiện và định lượng, yêu cầu pháp lý, năng lực thiết bị cũng như phương pháp thử đã được xác nhận.

* Bước 6: Xử lý dữ liệu và đánh giá kết quả

- Kết quả được tính toán dựa trên đường chuẩn và quy trình định lượng đã được thẩm định. Phòng thí nghiệm cần xem xét thời gian lưu, tín hiệu của chất phân tích, các tiêu chí nhận diện và những yếu tố ảnh hưởng đến kết quả.

- Các chỉ tiêu kiểm soát chất lượng có thể bao gồm:

• Mẫu blank phương pháp.
• Mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu kiểm soát có giá trị tham chiếu phù hợp.
• Độ thu hồi của mycotoxin qua toàn bộ quy trình.
• Độ lặp lại và độ tái lập theo yêu cầu.
• Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
• Đánh giá ảnh hưởng nền và độ ổn định của tín hiệu.

- Chỉ nên báo cáo kết quả khi các tiêu chí chấp nhận của phương pháp được đáp ứng.

3. Kết nối IAC với hệ thống HPLC/LC-MS/MS như thế nào?

- IAC và hệ thống sắc ký đảm nhiệm hai vai trò khác nhau nhưng bổ trợ trực tiếp cho nhau.

- IAC tập trung vào việc làm sạch và thu giữ chất phân tích mục tiêu, trong khi HPLC hoặc LC-MS/MS thực hiện tách, nhận diện và định lượng độc tố.

* Quy trình tổng thể có thể mô tả như sau:

Mẫu thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi → Chiết xuất → Lọc và pha loãng → Làm sạch bằng IAC → Giải hấp → Chuẩn bị dịch mẫu → HPLC/LC-MS/MS → Xử lý dữ liệu và báo cáo kết quả.

- Trong quy trình này, IAC thường được sử dụng như một công đoạn tiền xử lý ngoại tuyến (offline), nghĩa là mẫu được làm sạch trên cột riêng trước khi đưa vào thiết bị sắc ký. Cột IAC không mặc nhiên được lắp trực tiếp nối tiếp với cột HPLC.

- Sự kết hợp đúng cách giúp giảm tải thành phần nền lên hệ thống sắc ký, hỗ trợ duy trì hiệu suất phân tích và nâng cao độ tin cậy của kết quả.

4. Những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả phân tích Mycotoxin bằng IAC và HPLC

Lựa chọn cột IAC không phù hợp

Mỗi loại cột có đặc tính liên kết, dung lượng và phạm vi ứng dụng riêng. Sử dụng cột không đúng độc tố mục tiêu hoặc vượt quá dung lượng khuyến nghị có thể làm giảm hiệu suất thu hồi.

Chiết xuất mẫu chưa tối ưu

Dung môi chiết, thời gian chiết và tỷ lệ mẫu/dung môi có thể ảnh hưởng đến lượng độc tố được giải phóng khỏi nền mẫu. Quy trình cần được lựa chọn phù hợp với từng nền mẫu và xác nhận hiệu năng thực tế.

Tốc độ dòng và điều kiện nạp mẫu không đúng

Tốc độ dòng quá cao hoặc điều kiện nạp mẫu không tương thích với hướng dẫn sử dụng có thể ảnh hưởng đến khả năng liên kết giữa kháng thể và mycotoxin.

Hiệu ứng nền trong LC-MS/MS

Ngay cả sau khi làm sạch, một số thành phần nền vẫn có thể ảnh hưởng đến quá trình ion hóa, dẫn đến ức chế hoặc tăng cường tín hiệu. Vì vậy, sử dụng IAC không đồng nghĩa với việc loại bỏ hoàn toàn hiệu ứng nền; cần đánh giá bằng các thí nghiệm phù hợp.

Thiếu bước kiểm soát chất lượng

Một kết quả có tín hiệu rõ ràng chưa đủ để khẳng định độ chính xác. Việc đánh giá độ thu hồi, độ lặp lại, LOD, LOQ và các tiêu chí thẩm định liên quan là cần thiết để chứng minh tính phù hợp của phương pháp.

5. Ứng dụng của IAC trong kiểm nghiệm độc tố nấm mốc

Cột ái lực miễn dịch có thể được sử dụng trong các quy trình kiểm nghiệm mycotoxin ở nhiều lĩnh vực, tùy loại cột và phạm vi ứng dụng đã được xác nhận.

- Ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc: Kiểm soát các độc tố như aflatoxin, DON, zearalenone hoặc fumonisin theo phương pháp phù hợp.

- Đậu phộng, hạt có dầu và các loại hạt: Phân tích aflatoxin và các độc tố mục tiêu liên quan.

- Cà phê, gia vị và nguyên liệu thực phẩm: Hỗ trợ làm sạch mẫu trước khi định lượng độc tố phù hợp.

- Sữa và sản phẩm từ sữa: Kiểm nghiệm aflatoxin M1 theo quy trình đã được thẩm định.

- Thức ăn chăn nuôi: Giám sát các độc tố nấm mốc có thể ảnh hưởng đến chất lượng nguyên liệu và an toàn thức ăn chăn nuôi.

Việc lựa chọn cột cần dựa trên loại độc tố cần phân tích, nền mẫu, giới hạn định lượng và yêu cầu của phương pháp. Không phải tất cả các loại cột IAC đều thích hợp cho mọi ứng dụng kể trên.

6. Vì sao nên lựa chọn cột IAC chất lượng cho phòng kiểm nghiệm?

- Trong một quy trình phân tích, thiết bị HPLC/LC-MS/MS chỉ là một phần của hệ thống. Chất lượng bước chuẩn bị mẫu cũng ảnh hưởng trực tiếp đến độ tin cậy của kết quả cuối cùng.

- Cột IAC phù hợp có thể giúp phòng thí nghiệm:

• Nâng cao tính chọn lọc của bước làm sạch mẫu.
• Giảm nhiễu từ các thành phần nền không mong muốn.
• Hỗ trợ đạt hiệu suất thu hồi phù hợp khi quy trình được tối ưu.
• Chuẩn hóa thao tác tiền xử lý mẫu.
• Hỗ trợ bảo vệ hệ thống sắc ký khỏi một phần thành phần nền gây nhiễm bẩn.

- Khi lựa chọn sản phẩm, phòng thí nghiệm nên kiểm tra loại độc tố mục tiêu, dung lượng cột, nền mẫu đã được xác nhận, dung môi tương thích, hướng dẫn sử dụng và dữ liệu hiệu năng từ nhà sản xuất.

7. Cột ái lực miễn dịch IAC R-Biopharm – Giải pháp làm sạch mẫu Mycotoxin

- Đối với các phòng thí nghiệm cần xây dựng hoặc tối ưu quy trình kiểm nghiệm độc tố nấm mốc, cột ái lực miễn dịch IAC của R-Biopharm là một lựa chọn đáng xem xét khi sản phẩm cụ thể phù hợp với chất phân tích và nền mẫu cần kiểm tra.

- Giải pháp IAC có thể được tích hợp vào quy trình tiền xử lý mẫu trước khi phân tích bằng HPLC hoặc LC-MS/MS, giúp tăng tính chọn lọc của bước làm sạch và hỗ trợ nâng cao chất lượng dữ liệu phân tích.

- Khi lựa chọn cột IAC R-Biopharm, doanh nghiệp nên xác định trước:

• Loại mycotoxin cần kiểm nghiệm.
• Nền mẫu cần phân tích.
• Hệ thống sắc ký đang sử dụng: HPLC-FLD hay LC-MS/MS.
• Giới hạn định lượng mong muốn.
• Yêu cầu về phương pháp thử, độ thu hồi và thẩm định.

- Việc lựa chọn đúng sản phẩm và xây dựng quy trình phù hợp sẽ giúp phòng thí nghiệm tối ưu công đoạn chuẩn bị mẫu, hướng đến kết quả phân tích ổn định và đáng tin cậy.

- Liên hệ với đơn vị cung cấp thiết bị và vật tư kiểm nghiệm để được tư vấn lựa chọn cột IAC R-Biopharm phù hợp với loại độc tố, nền mẫu và hệ thống phân tích đang sử dụng.

👉  Tham khảo bài viết Các loại cột ái lực miễn dịch IAC của R-Biopharm cho từng loại độc tố nấm mốc

Kết luận

- Quy trình kiểm nghiệm độc tố nấm mốc bằng IAC kết hợp HPLC/LC-MS/MS là sự phối hợp giữa bước làm sạch mẫu có tính chọn lọc và kỹ thuật phân tích sắc ký hiện đại. Trong đó, IAC giữ vai trò quan trọng ở giai đoạn tiền xử lý, giúp giảm ảnh hưởng của nền mẫu và hỗ trợ cải thiện độ tin cậy của kết quả khi được sử dụng đúng cách.

- Để tối ưu quy trình phân tích mycotoxin HPLC, phòng thí nghiệm cần lựa chọn cột IAC phù hợp, kiểm soát điều kiện chiết xuất và giải hấp, đồng thời xác nhận hiệu năng của toàn bộ phương pháp thông qua các chỉ tiêu kiểm soát chất lượng.

- Đầu tư đúng vào bước làm sạch mẫu là một trong những yếu tố giúp phòng thí nghiệm xây dựng quy trình kiểm nghiệm mycotoxin hiệu quả, ổn định và phù hợp với yêu cầu phân tích thực tế.