- Christelle Robert
- Marijn Van Hulle
- Simon Hird
- Luc Demoulin
- Gilles Pierret
- Nathalie Gillard
- CER Groupe
- Waters Corporation
Tóm tắt
Tài liệu ứng dụng này trình bày kết quả thẩm định thành công phương pháp phân tích mô tôm để xác định tetracycline, sulfonamide, trimethoprim, ormetoprim và dapsone, sử dụng hệ thống Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS kết nối với thiết bị Xevo TQ-S micro.
Lợi ích
- Phân tích đồng thời nhiều loại tetracycline, sulfonamide và các kháng sinh thú y liên quan trong một phép phân tích.
- Quy trình làm sạch hiệu quả, thể tích tiêm mẫu nhỏ và khối phổ có độ nhạy cao kết hợp tạo nên giải pháp phân tích ổn định, đáng tin cậy.
- Kết quả thẩm định thành công giúp tăng độ tin cậy về tính phù hợp của phương pháp.
Giới thiệu
Thuốc thú y được sử dụng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản để điều trị hoặc phòng bệnh, và trong một số trường hợp nhằm thúc đẩy tăng trưởng vật nuôi. Nếu không tuân thủ thời gian ngừng thuốc theo quy định, các sản phẩm dùng làm thực phẩm như sữa, trứng và thịt có thể chứa tồn dư kháng sinh hoặc chất chuyển hóa ở mức không an toàn. Để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng, tôm và các loại hải sản khác thường được nuôi tại các trang trại thủy sản, nơi mật độ nuôi cao khiến vật nuôi dễ mắc bệnh hơn. Kháng sinh được sử dụng rộng rãi nhằm duy trì sức khỏe vật nuôi, bảo đảm sản lượng và tăng năng suất. Tồn dư kháng sinh trong thực phẩm có nguồn gốc động vật là mối quan ngại lớn vì có thể gây hại cho sức khỏe người tiêu dùng và thúc đẩy mầm bệnh phát triển khả năng kháng thuốc.¹
Các cơ quan quản lý kiểm soát việc sử dụng thuốc thú y bằng cách quy định giới hạn dư lượng tối đa (MRL) hoặc cấm sử dụng một số chất nhằm bảo đảm an toàn thực phẩm và tạo thuận lợi cho thương mại quốc tế. Tại EU, theo tài liệu gốc, MRL được quy định cho một số chất và áp dụng cho tất cả các loài động vật được dùng làm thực phẩm. Đối với sulfonamide, MRL được tính theo tổng dư lượng của tất cả các chất trong nhóm; đối với tetracycline, MRL liên quan đến tổng hàm lượng thuốc gốc và đồng phân 4-epimer, ngoại trừ doxycycline (DC).² Dapsone, demeclocycline và ormetoprim không được phê duyệt sử dụng cho động vật làm thực phẩm tại EU nên không có MRL; tuy nhiên, dapsone có mức nồng độ khuyến nghị (RC) là 5 μg/kg.³ Khi một chất bị cấm, giới hạn quyết định CCα và khả năng phát hiện CCβ cần thấp nhất có thể đạt được một cách hợp lý (ALARA).
Hoạt động giám sát kết hợp với thực thi, điều tra và thanh tra hiệu quả giúp bảo đảm thuốc thú y được sử dụng an toàn và đúng mục đích. Các nước EU phải triển khai kế hoạch giám sát dư lượng để phát hiện việc sử dụng trái phép hoặc sai mục đích thuốc thú y ở động vật làm thực phẩm, đồng thời điều tra nguyên nhân khi phát hiện vi phạm. Các nước ngoài EU xuất khẩu vào EU cũng phải triển khai kế hoạch giám sát dư lượng nhằm bảo đảm mức độ an toàn thực phẩm tương đương.
Do đó, cần phát triển phương pháp đơn giản nhưng chính xác để xác định dư lượng nhiều loại kháng sinh trong hải sản. Tài liệu này trình bày kết quả thẩm định thành công phương pháp phân tích mô tôm để xác định tetracycline, sulfonamide, trimethoprim, ormetoprim và dapsone bằng hệ thống Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS kết nối với Xevo TQ-S micro.
Thực nghiệm
Chiết mẫu và làm sạch
Sau khi bổ sung chất chuẩn nội, mô tôm được chiết bằng hỗn hợp tác nhân tạo phức nhằm cải thiện hiệu suất chiết tetracycline, sau đó làm sạch bằng chiết pha rắn (SPE) (xem Hình 1). Các dung dịch chuẩn phù hợp nền mẫu được pha trong dịch chiết mô tôm đã xác nhận là mẫu trắng, ở các nồng độ nêu trong Bảng 1.
Bảng 1. Nồng độ từng kháng sinh trong các dung dịch chuẩn phù hợp nền mẫu. Methacycline, trimethoprim-d9, 3-aminophenyl sulfone, sulfadiazine-13C6 và sulfadimidine-13C6 được sử dụng làm chất chuẩn nội để định lượng (xem Bảng 2).
Hình 1. Tổng quan các bước chuẩn bị mẫu.
Thông số UPLC
Hệ thống: | ACQUITY UPLC I-Class PLUS với FTN Sample Manager |
Cột: | ACQUITY HSS C18, 1.8 μm, 2.1 × 100 mm (p/n: 186003533) |
Nhiệt độ cột: | 25 °C |
Nhiệt độ mẫu: | 10 °C |
Thông số tiêm: | 1 μL |
Pha động A: | Nước + 0.1% axit formic |
Pha động B: | Methanol + 0.1% axit formic |
Dung môi rửa của bộ quản lý mẫu: | Nước/methanol/isopropanol/acetonitrile 25/25/25/25 có 0.2% axit formic |
Chương trình gradient
Thông số khối phổ (MS)
Hệ thống MS: | Xevo TQ-S micro |
Cực tính: | ESI+ |
Điện thế mao quản: | 2.0 kV |
Nhiệt độ nguồn: | 150 °C |
Nhiệt độ khử dung môi: | 650 °C |
Lưu lượng khí khử dung môi: | 1000 L/hr |
Lưu lượng khí cone: | 50 L/hr |
Mỗi hợp chất được theo dõi bằng hai chuyển tiếp MRM. Thời gian thu nhận cho mỗi chuyển tiếp được thiết lập tự động bằng chức năng autodwell để bảo đảm có ít nhất 12 điểm dữ liệu trên mỗi pic. Dữ liệu được thu nhận bằng phần mềm MassLynx và xử lý bằng TargetLynx XS Application Manager. Bảng 2 tổng hợp các chuyển tiếp MRM và thời gian thu nhận thực tế đã thiết lập. Các chuyển tiếp dùng để định lượng được in đậm.
Bảng 2. Các thông số phương pháp MS của tất cả kháng sinh và chất chuẩn nội.
Thẩm định phương pháp
Việc thẩm định được thực hiện với mẫu trắng thêm chuẩn theo hướng dẫn 2002/657/EC.⁴ Các thông số được đánh giá gồm: nhận diện, tính chọn lọc, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại trong phòng thí nghiệm (RSDr), độ tái lập trong phòng thí nghiệm (RSDRL), giới hạn quyết định (CCα) và khả năng phát hiện (CCβ). Khả năng nhận diện được đánh giá qua thời gian lưu, tỷ lệ ion và số điểm nhận diện. Tính chọn lọc của phương pháp được kiểm tra bằng các mẫu mô tôm trắng để xác định chất gây nhiễu rửa giải tại và quanh thời gian lưu của các chất phân tích. Tính tuyến tính của đường chuẩn và từng giá trị phần dư được kiểm tra. Cùng một người phân tích chuẩn bị và phân tích các mẫu mô tôm thêm chuẩn lặp lại vào ba ngày riêng biệt. Với những chất có MRL, mẫu được thêm chuẩn ở mức 0.5, 1.0 và 1.5 lần MRL (xem Bảng 1). Tuy nhiên, do MRL của tetracycline được tính theo tổng thuốc gốc và đồng phân 4-epimer, nồng độ thêm chuẩn của từng hợp chất được giảm một nửa, còn 25, 50 và 75 μg/kg; nồng độ xác định được của thuốc gốc và epimer được cộng lại trước khi tính các thông số thẩm định. Với những chất không có MRL, việc đánh giá được thực hiện ở mức 0.5, 1.0 và 1.5 lần nồng độ mục tiêu (TL). CCα và CCβ được tính từ RSDRL theo định nghĩa trong 2002/657/EC.
Kết quả và thảo luận
Sắc ký
Cột HSS C18 cho khả năng lưu giữ và hình dạng pic rất tốt đối với tất cả chất phân tích mà không cần bổ sung thuốc thử tạo cặp ion vào pha động cho tetracycline.⁵ Việc kết hợp cột HSS C18 với methanol thay cho acetonitrile và nhiệt độ cột thấp giúp tách hoàn toàn thuốc gốc và các dạng epimer (Hình 2).
Hình 2. Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn phù hợp nền mẫu tại mức MRL, thể hiện sự phân tách các tetracycline.
Độ đặc hiệu, độ chọn lọc, nhận diện và tiêu chí hiệu chuẩn
Trong mỗi ngày của ba ngày thử nghiệm, bảy mẫu tôm trắng được chuẩn bị và phân tích. Không phát hiện tín hiệu trong dịch chiết có thể dẫn đến kết luận nhầm rằng mẫu không phù hợp. Một số hợp chất được phát hiện ở mức vết, nhưng nồng độ ước tính thấp hơn nhiều so với chuẩn thấp nhất. Mỗi ngày đều chuẩn bị đường chuẩn 7 điểm trong dịch chiết nền mẫu và thu nhận dữ liệu. Hai chuyển tiếp của mỗi chất phân tích đáp ứng đủ số điểm nhận diện yêu cầu (ba điểm với chất có MRL và bốn điểm với chất bị cấm), cho pic có tỷ lệ ion và thời gian lưu nằm trong dung sai khuyến nghị khi so sánh với chuẩn. Áp dụng hồi quy tuyến tính với trọng số 1/x, tất cả hệ số xác định (R2) của đường chuẩn đều >0.99; từng giá trị phần dư đều <20% (phần lớn <5%), cho thấy khả năng định lượng đáng tin cậy. Hình 3 trình bày một số đường chuẩn điển hình.
Hình 3. Ví dụ về đường chuẩn và đồ thị phần dư của một số kháng sinh trong phương pháp này.
Độ nhạy
Phân tích các chuẩn trên nền mẫu cho thấy độ nhạy rất tốt. Hình 4 trình bày sắc ký đồ điển hình của một số kháng sinh khi phân tích chuẩn trên nền mẫu ở nồng độ thấp nhất. Kết quả cho thấy phương pháp có thể phát hiện các kháng sinh này trong dịch chiết ở nồng độ thấp hơn nhiều, hoặc có thể pha loãng thêm dịch chiết cuối trước khi phân tích LC-MS/MS.
Hình 4. Sắc ký đồ của một số kháng sinh khi phân tích dung dịch chuẩn phù hợp nền mẫu ở nồng độ thấp nhất (nồng độ nêu trong Bảng 1; chuyển tiếp ion nêu trong Bảng 2).
Độ đúng và độ lặp lại
Độ đúng, biểu thị bằng độ thu hồi đo được, được đánh giá từ dữ liệu phân tích các mẫu thêm chuẩn trong ba ngày. Độ thu hồi trung bình của từng nhóm bảy mẫu thêm chuẩn ở ba mức nồng độ, được chuẩn bị và phân tích trong ba ngày, nằm trong khoảng 88.6%–106%. Như vậy, các kết quả đáp ứng tiêu chí trong Quyết định 2002/657/EC của Ủy ban châu Âu. Độ lặp lại của phương pháp cũng đạt yêu cầu với tất cả chất phân tích trong các nghiên cứu RSDr (0.9%–10.2%) và RSDRL (1.1%–9.8%). Độ đúng và độ lặp lại được trình bày ở Hình 5, Hình 6 và Bảng 3; bảng này cũng cung cấp giá trị CCα và CCβ.
Hình 5. Biểu đồ hiệu suất thu hồi (%) của các mẫu bổ sung chuẩn được phân tích trong ngày 1, ngày 2 và ngày 3.
Hình 6. Biểu đồ độ lặp lại (% RSDr và RSDRL) của các mẫu bổ sung chuẩn được phân tích trong ngày 1, ngày 2 và ngày 3.
Bảng 3. Kết quả thẩm định phương pháp xác định kháng sinh trong mô tôm.
Kết luận
Phương pháp này là phương pháp phân tích đa dư lượng có độ nhạy cao và độ ổn định tốt để xác định tetracycline, sulfonamide, trimethoprim, ormetoprim và dapsone, sử dụng hệ thống ACQUITY UPLC I-Class PLUS kết nối với hệ thống MS/MS Xevo TQ-S micro. Phương pháp cho phép định lượng nhanh và đáng tin cậy ở nồng độ thấp hơn đáng kể so với các MRL thông thường, đồng thời được thẩm định thành công theo Quyết định 2002/657 của Ủy ban châu Âu, cho kết quả đạt yêu cầu đối với tetracycline, sulfonamide và các kháng sinh liên quan trong mô tôm. Sau khi được thẩm định phù hợp, quy trình có thể áp dụng cho các mô động vật và cá khác. Phương pháp có chi phí hợp lý, dễ triển khai tại các phòng thử nghiệm thường quy, phù hợp để kiểm tra tuân thủ MRL và có tiềm năng sàng lọc ở nồng độ thấp hơn, chẳng hạn phục vụ kiểm nghiệm phục vụ hoạt động thẩm tra cần thiết của doanh nghiệp thực phẩm.
Tài liệu tham khảo
- Chen, J. et al. (2019). Antibiotic Residues in Food: Extraction, Analysis, and Human Health Concerns. J. Agric. Food Chem. 67:7569–7586.
- Anon (2009). Commission Regulation (EU) No 37/2010 of 22 December 2009 on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum residue limits in foodstuffs of animal origin. OJ L 15, 20.1.2010, p. 1–72.
- Anon (2017). CRL Guidance Paper (7 December 2007). CRLs View on State of the Art Analytical Methods for National Residue Control Plans. Community Reference Laboratories (CRLs) for Residues According to Council Directive 96/23/EC.
- Anon (2002). 2002/657/EC: Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. OJ L 221, 17.8.2002, p. 8–36.
- Young, M.S.; Van Tran, K. HPLC/UV Determination of Tetracyclines in Milk Using Mixed-Mode SPE and eXtended Performance [XP] 2.5 μm Columns. Waters Corporation Application Note. 720004582EN. 2013.