• Dimple D. Shah
  • JodiAnn Wood
  • Gordon Fujimoto
  • Eimear McCall
  • Simon Hird
  • Peter Hancock
  • Waters Corporation

Tóm tắt

Trong tài liệu ứng dụng này, chúng tôi trình bày phương pháp UPLC-MS/MS đa dư lượng được phát triển để xác định 552 loại thuốc bảo vệ thực vật và các chất chuyển hóa liên quan trong dịch chiết trái cây, rau củ, ngũ cốc và trà đen, sử dụng hệ thống ACQUITY UPLC I-Class kết hợp với Xevo TQ-XS.

Lợi ích

  • Hệ thống ACQUITY UPLC I-Class kết nối với Xevo TQ-XS cho phép xác định 552 loại thuốc bảo vệ thực vật trong nhiều loại nông sản, thực phẩm ở nồng độ thấp hơn MRL mặc định của EU chỉ bằng một phương pháp.
  • Trong cả năm nền mẫu, dù dịch chiết QuEChERS thô đã được pha loãng, phần lớn hợp chất vẫn được phát hiện ở nồng độ thấp hơn MRL mặc định thông thường của EU là 0.01 mg/kg.
  • Bộ trộn sau bộ phận tiêm mẫu giúp duy trì hình dạng pic Gaussian của các hợp chất rửa giải sớm.

Giới thiệu

Khi dân số tăng, nhu cầu tiêu thụ thực phẩm và thương mại toàn cầu trong ngành thực phẩm cũng gia tăng. Hàng trăm loại thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng thường xuyên để bảo vệ cây trồng trên toàn thế giới; lượng thuốc còn sót lại trong nông sản sau xử lý được gọi là “dư lượng”. Các quy định về giới hạn dư lượng tối đa (MRL) xác định mức dư lượng được pháp luật cho phép có trong hoặc trên thực phẩm và thức ăn chăn nuôi khi thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng đúng theo Thực hành nông nghiệp tốt (GAP). Danh mục chất cần phân tích ngày càng mở rộng, nền mẫu phức tạp và yêu cầu giới hạn phát hiện thấp tạo ra nhiều thách thức đối với các phương pháp phân tích đa dư lượng.

Phương pháp đa dư lượng được phát triển để phân tích 552 loại thuốc bảo vệ thực vật và các chất chuyển hóa liên quan trong nhiều nhóm thực phẩm. Để đánh giá hiệu năng UPLC-MS/MS, nghiên cứu lựa chọn các nền mẫu đại diện: rau bina có hàm lượng nước cao; dâu tây có độ axit và hàm lượng nước cao; đậu nành có hàm lượng dầu cao và rất ít nước; bột mì có hàm lượng protein cao nhưng hàm lượng nước và chất béo thấp; cùng trà đen là nền mẫu khó hoặc có đặc tính riêng.

Thực nghiệm

Chuẩn bị mẫu

Các mẫu đại diện được chọn từ những nhóm nông sản, thực phẩm khác nhau, gồm: nhóm có hàm lượng nước cao (rau bina); nhóm có hàm lượng axit và nước cao (dâu tây); nhóm có hàm lượng dầu cao và nước rất thấp (đậu nành); nhóm có hàm lượng protein cao, nước và chất béo thấp (bột mì); và nhóm mẫu khó hoặc có tính chất đặc thù (trà đen). Các mẫu được mua tại một cửa hàng bán lẻ địa phương, đồng nhất ngay bằng máy chế biến thực phẩm rồi bảo quản đông lạnh cho đến khi chiết. Mẫu được chiết bằng phương pháp QuEChERS CEN. Với mẫu có hàm lượng nước cao, như rau bina và dâu tây, việc chuẩn bị mẫu tuân theo phương pháp cho rau quả của Phòng thí nghiệm tham chiếu Liên minh châu Âu (EURL).¹ Với mẫu có hàm lượng nước trung bình hoặc thấp, như đậu nành và bột mì, sử dụng phương pháp EURL cho ngũ cốc và thức ăn chăn nuôi.² Với mẫu ít nước và nhiều carbohydrate, như trà, áp dụng quy trình chiết QuEChERS có bước làm sạch mẫu.³

Hình 1. Quy trình chuẩn bị mẫu 5 nền mẫu

Hình 1. Quy trình chuẩn bị mẫu dâu tây, rau bina, đậu nành, bột mì và trà đen.

Hiệu năng phương pháp UPLC-MS/MS được đánh giá bằng cách thêm hỗn hợp 256 loại thuốc bảo vệ thực vật (xem chi tiết trong Phụ lục) vào dịch chiết rau bina, dâu tây, đậu nành, bột mì và trà đen ở tám mức nồng độ từ 0.0001 đến 0.1 mg/kg. Các chuẩn hiệu chuẩn trên nền mẫu được tiêm theo cách mô phỏng việc phân tích một lô mẫu: các lần tiêm chuẩn được bố trí trước và sau chuỗi tiêm lặp lại (n=6) ở ba mức nồng độ trên nền mẫu.

Bảng 1. Ví dụ MRL mặc định 0,01 mg/kg

Bảng 1. Ví dụ về MRL mặc định 0,01 mg/kg đối với dâu tây, rau bina, đậu nành, bột mì và trà đen, cùng hệ số pha loãng từ quy trình chuẩn bị mẫu QuEChERS và nồng độ tương đương trong lọ. Để thuận tiện trình bày, tất cả nồng độ của dung dịch chuẩn, mẫu kiểm soát chất lượng (QC) và mẫu thử trong tài liệu này được biểu thị bằng mg/kg.

Điều kiện UPLC-MS/MS

Điều kiện UPLC-MS/MS / UPLC-MS/MS conditions

Hệ thống UPLC:

ACQUITY UPLC I-Class với FL Sample Manager

Cột:

Cột ACQUITY UPLC HSS T3, 1.8 μm, 2.1 × 100 mm (186003539)

Bộ trộn sau bộ phận tiêm mẫu:

Vòng nối dài 50 μL (430002012)

Pha động A:

Ammonium formate 5 mM trong nước + 0.1% axit formic

Pha động B:

Ammonium formate 5 mM trong MeCN:MeOH 50:50 + 0.1% axit formic

Thể tích tiêm:

5 μL (chế độ PLNO)

Nhiệt độ cột:

40 °C

Nhiệt độ mẫu:

10 °C

Thời gian chạy:

19 phút

Thu nhận và xử lý dữ liệu:

MassLynx 4.2 và TargetLynx XS

Thiết bị MS:

Xevo TQ-XS

Phương pháp ion hóa:

Ion hóa phun điện (ESI)

Cực tính:

Chế độ ion dương và ion âm

Điện thế mao quản:

+2.0/-2.0 kV

Nhiệt độ khử dung môi:

300 °C

Lưu lượng khí khử dung môi:

1000 L/Hr

Nhiệt độ nguồn:

150 °C

Lưu lượng khí cone:

150 L/Hr

Dung môi rửa kim mạnh (SNW):

0.1% axit formic trong acetonitrile

Dung môi rửa kim yếu (WNW):

Pha động A

Dung môi rửa phớt:

10% methanol trong nước

Chương trình gradient:

Chương trình gradient

Phương pháp LC-MS/MS cho 552 loại thuốc bảo vệ thực vật được xây dựng bằng cơ sở dữ liệu Quanpedia. Quanpedia tự động tạo phương pháp thu nhận dữ liệu LC và MS cũng như phương pháp xử lý từ tập hợp thông số MS đặc trưng của từng hợp chất, như chuyển tiếp, điện thế cone và năng lượng va chạm. Phương pháp MS sử dụng trong nghiên cứu có ít nhất 2 chuyển tiếp MRM cho mỗi loại thuốc bảo vệ thực vật, với tổng cộng hơn 1000 MRM. Chức năng auto-dwell tự động điều chỉnh thời gian thu nhận của từng chuyển tiếp, bảo đảm mỗi pic có đủ số điểm dữ liệu cần thiết (10–14 điểm). Hình 2 minh họa việc tạo phương pháp phân tích đa dư lượng trong Quanpedia.

Hình 2. Tạo phương pháp đa dư lượng bằng Quanpedia

Hình 2. Tạo phương pháp đa dư lượng để xác định 552 loại thuốc bảo vệ thực vật bằng Quanpedia.

Kết quả và thảo luận

Sắc ký

Phương pháp đa dư lượng này được phát triển cho nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật có tính chất hóa học khác nhau. Một số chất, chẳng hạn methamidophos và acephate, có tính phân cực rất cao nên rửa giải sớm trên sắc ký đồ. Khi tiêm mẫu chứa tỷ lệ dung môi hữu cơ ở mức tương đối cao (25%), các chất rửa giải sớm thường xuất hiện pic bị bè đầu và/hoặc tách đôi. Giảm tỷ lệ dung môi hữu cơ trong dung môi pha mẫu trước khi tiêm có thể cải thiện hình dạng pic của các chất phân tích rửa giải sớm. Việc lắp bộ trộn sau bộ phận tiêm mẫu giữa cổng tiêm và cột cho phép đưa dịch chiết QuEChERS thông thường vào pha động có hàm lượng nước cao mà không làm giảm chất lượng pic. Trước khi tiêm, vòng nối dài được nạp pha động giàu nước, tạo thêm thể tích để phân tán mẫu vào dung môi nước trước khi chuyển lên cột. Nhờ vậy, vẫn có thể sử dụng dung môi hữu cơ ở mức vừa phải (25%) để chuẩn bị mẫu, giúp phần lớn thuốc bảo vệ thực vật duy trì trạng thái hòa tan đồng thời bảo đảm hình dạng pic tốt cho các chất có độ phân cực rất cao. Hình 3 so sánh pic methamidophos khi có và không có bộ trộn sau bộ phận tiêm mẫu. Khi lắp vòng nối dài, pic có hình dạng tốt hơn, giúp định lượng đáng tin cậy hơn, tăng độ nhạy và do đó đạt giới hạn phát hiện (LOD) thấp hơn.

Hình 3. Sắc ký đồ methamidophos có/không bộ trộn sau injector

Hình 3. Sắc ký đồ của methamidophos khi có (đường màu xanh lá) và không có (đường màu đỏ) bộ trộn sau bộ phận tiêm mẫu.

Như trình bày ở Hình 4, methamidophos có thời gian lưu khoảng 1.9 phút và độ rộng pic tại đường nền khoảng 7 giây trong tất cả nền mẫu được khảo sát. Thời gian lưu của methamidophos lớn hơn hai lần thời gian tương ứng với thể tích rỗng của cột (thời gian chết 0.46 phút).

Hình 4. Sắc ký đồ các chất phân cực mạnh trên các nền mẫu

Hình 4. Sắc ký đồ của một số chất phân tích có độ phân cực rất cao trên các nền mẫu khi đã lắp bộ trộn sau bộ phận tiêm mẫu.

Độ nhạy, định lượng, độ chụm và ảnh hưởng nền mẫu

Đối với phần lớn trong số 256 hợp chất ở tất cả các nền mẫu, đường chuẩn có hệ số xác định (R²) lớn hơn 0,99 và nồng độ tính ngược (phần dư) đều nằm trong giới hạn dung sai ±20% của SANTE.⁴ Hình 5 trình bày đường chuẩn tương thích nền mẫu của metoxuron, một chất phân tích đại diện, trong năm nền mẫu được nghiên cứu.

Hình 5. Đường chuẩn tương thích nền mẫu

Hình 5. Đường chuẩn tương thích nền mẫu trong khoảng 0,0001–0,1 mg/kg (tương đương 0,1–100 ng/mL) của metoxuron trong rau bina, dâu tây, đậu nành, bột mì và trà đen.

Độ chụm của phép đo LC-MS/MS được tính cho 256 loại thuốc bảo vệ thực vật đại diện từ các phép xác định lặp lại (n=6) chuẩn trên nền mẫu ở ba nồng độ (0.005, 0.01 và 0.05 mg/kg). Phép đo có độ chụm tốt: hơn 85% số thuốc bảo vệ thực vật được phát hiện có RSD diện tích pic dưới 10% (xem Hình 6).

Hình 6. Tỷ lệ thuốc BVTV có RSD <10%

Hình 6. Tỷ lệ thuốc bảo vệ thực vật có RSD <10% trong các nền mẫu ở mức 0,005 mg/kg, 0,01 mg/kg và 0,05 mg/kg.

Hiệu ứng nền của 256 hợp chất trong các nền mẫu khác nhau được tính bằng cách so sánh tỷ số giữa hệ số góc của đường chuẩn trên từng nền mẫu với hệ số góc của đường chuẩn trong dung môi. Hình 7 tổng hợp mức độ hiệu ứng nền quan sát được ở từng loại mẫu. Tất cả loại mẫu đều có mức độ ức chế tín hiệu (đáp ứng giảm >20%) và tăng cường tín hiệu (đáp ứng của chất phân tích tăng >20%) nhất định, vì vậy nên sử dụng hiệu chuẩn trên nền mẫu. Hiệu chuẩn theo toàn bộ quy trình hoặc phương pháp thêm chuẩn là những lựa chọn khác giúp bù cả hiệu ứng nền lẫn tổn thất độ thu hồi.

Hình 7. Tỷ lệ thuốc BVTV chịu ảnh hưởng nền mẫu

Hình 7. Tỷ lệ thuốc bảo vệ thực vật có ảnh hưởng nền mẫu đáng kể trong rau bina, dâu tây, đậu nành, bột mì và trà đen.

Để khảo sát sâu hơn về hiệu ứng nền, mẫu đậu nành được chuẩn bị bằng QuEChERS rồi pha loãng dịch chiết 5 lần và 10 lần. Chuẩn hiệu chuẩn trên nền mẫu được pha ở nồng độ 0.02 mg/kg trong cả dịch chiết thô lẫn dịch chiết đã pha loãng, sau đó đem phân tích. Để khảo sát tác động của các chất đồng chiết, chế độ thu nhận quét toàn dải RADAR được kích hoạt đồng thời với các chuyển tiếp MRM của 552 hợp chất quan tâm. Hình 8 trình bày sắc ký đồ tổng dòng ion (TIC) chồng từ RADAR của các dịch chiết đậu nành khác nhau. Một pic lớn được quan sát ở 3.9 phút trên sắc ký đồ của dịch chiết thô (màu xanh dương). Carbofuran 3-hydroxy, một hợp chất cần phân tích, cũng rửa giải ở 3.9 phút với chương trình gradient LC này.

Hình 8. Tín hiệu RADAR dịch chiết QuEChERS đậu nành

Hình 8. Tín hiệu RADAR của dịch chiết QuEChERS đậu nành nguyên bản (xanh dương), dịch chiết pha loãng 5 lần (hồng) và 10 lần (vàng). Hình nhỏ 8a trình bày sắc ký đồ carbofuran 3-hydroxy trong dịch chiết QuEChERS nguyên bản (xanh dương) và dịch chiết pha loãng 10 lần (vàng).

Các chất nền đồng chiết cùng rửa giải có thể gây tăng cường hoặc ức chế ion, hay gây nhiễu đẳng khối. Như thể hiện trong hình nhỏ 8a, diện tích pic carbofuran 3-hydroxy gần như tăng gấp đôi khi dịch chiết QuEChERS thô của đậu nành được pha loãng 10 lần (màu vàng), so với dịch chiết QuEChERS thô chưa pha loãng (màu xanh dương). Việc pha loãng dịch chiết QuEChERS thô (như Hình 8) giúp giảm hiệu ứng nền mà vẫn đạt LOD cần thiết, không cần bước làm sạch mẫu. Pha loãng cũng giảm lượng chất đồng chiết đưa vào hệ thống, kéo dài tuổi thọ cột UPLC, giảm tần suất bảo trì thiết bị định kỳ và nâng cao năng suất phân tích.

Tiêu chí nhận diện

Các tiêu chí nhận diện gồm thời gian lưu và tỷ lệ ion được tính toán và gắn cờ cảnh báo bằng TargetLynx XS. Thời gian lưu và tỷ lệ ion của mỗi chất phân tích được phát hiện trong mẫu phải tương ứng với chuẩn hiệu chuẩn tham chiếu.⁴ Thời gian lưu của toàn bộ 256 loại thuốc bảo vệ thực vật đại diện trong tất cả nền mẫu được nghiên cứu đều nằm trong dung sai ±0.1 phút. Tỷ lệ ion khi phân tích chuẩn hiệu chuẩn trên nền mẫu nằm trong khoảng ±30% so với giá trị tham chiếu đối với cả 256 hợp chất.

Kết luận

  • Đã phát triển một phương pháp UPLC-MS/MS đa dư lượng để xác định 552 loại thuốc bảo vệ thực vật và các chất chuyển hóa liên quan phục vụ phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật.
  • Quanpedia là cơ sở dữ liệu có thể mở rộng và tìm kiếm, cho phép tạo hiệu quả các phương pháp sắc ký, MS và xử lý TargetLynx để xác định 552 loại thuốc bảo vệ thực vật. Quanpedia cung cấp cách thức nhanh chóng, đơn giản để xây dựng và duy trì phương pháp.
  • Hiệu năng phương pháp UPLC-MS/MS được đánh giá qua việc xác định 256 chất phân tích đại diện trong dịch chiết của nhiều loại nông sản, thực phẩm.
  • Bộ trộn sau bộ phận tiêm mẫu cho phép tiêm ổn định các dịch chiết QuEChERS thông thường vào pha động giàu nước mà không làm giảm chất lượng hình dạng pic của các chất phân tích rửa giải sớm.
  • Pha loãng dịch chiết QuEChERS thô giúp giảm lượng chất đồng chiết đưa vào hệ thống và giảm tần suất bảo trì thiết bị định kỳ.
  • Trong cả năm nền mẫu, phần lớn hợp chất trong chuẩn hiệu chuẩn trên nền mẫu được phát hiện ở nồng độ thấp hơn MRL mặc định thông thường của EU là 0.01 mg/kg.

Tài liệu tham khảo

Hình minh họa bổ sung 1 (tài liệu gốc, không chú thích)
Hình minh họa bổ sung 2 (tài liệu gốc, không chú thích)
Hình minh họa bổ sung 3 (tài liệu gốc, không chú thích)

Sản phẩm nổi bật

Nguồn: Bài viết gốc trên Waters (tiếng Anh)