Vi sinh thực phẩm

Vi sinh thực phẩm và các trạng thái tồn tại

Vi sinh thực phẩm, là sinh vật đơn bào hoặc đa bào nhân sơ có kích thước rất nhỏ, không quan sát được bằng mắt thường mà phải sử dụng kính hiển vi. Vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong thực thực phẩm ở nhiều trạng thái khác nhau như:

Một số vi sinh vật thực phẩm phổ biến 

Có rất nhiều vụ ngộ độc hay nhiễm bệnh gây ra bởi vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm, nước uống, hay hóa mỹ phẩm. Môi trường sản xuất cũng cần được kiểm tra và vệ sinh hàng ngày. Kiểm soát vi sinh thực phẩm nguyên liệu đầu vào, quá trình sản xuất. chế biến và trong thành phẩm góp phần đảm bảo vệ sinh an toán thực phẩm.

Trong nước, bộ y tế quy định rõ giới hạn vi sinh vật trong thực phẩm theo quyết định số: 46/2007/QĐ-BYT. Ngoài ra QCVN 8-3:2012/BYT cũng đưa ra quy chuẩn kĩ thuật quốc gia đối với ô nhiễm vi sinh thực phẩm. 

Các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm

Các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm

1. Phương pháp nuôi cấy truyền thống

Phương pháp nuôi cấy truyền thống dựa trên khả năng tăng sinh tạo khuẩn lạc đặc trưng của từ loại vi khuẩn. Đây là phương pháp "tiêu chuẩn"  trong phân tích vi sinh thực phẩm.. Ưu điểm của phương pháp là nhạy, rẻ và dễ thực hiện, vừa định tính, định lượng các loại vi sinh vật sống hiện diện trong thực phẩm.
Nhược điểm: 
- Tốn thời gian, cần phải thực hiện rất nhiều bước như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, nuôi cấy trên môi trường chọn lọc và  tái xác nhận lại bằng các kiểm nghiệm sinh hóa và huyết thanh. Thông thường cần tốn khoảng 3-7 ngày để thực hiện toàn bộ quy trình trên tùy loại vi sinh vật.
- Sự phân bố không đồng đều của vi sinh trong mẫu và sự hiện diện của các vi sinh hiện hữu khác có thể làm ảnh hưởng đến độ đặc hiệu và tính chính xác của quy trình nuôi cấy.
- Phương pháp nuôi cấy không phù hợp cho kiểm tra vi sinh trong mẫu thực phẩm ở trạng thái tổn thương hoặc VBNC.
Để khắc phục nhược điểm về thời gian cũng như số thao tác của phương pháp đổ đĩa nuôi cấy truyền thống, hãng Nissui đã cho ra đời sản phẩm đĩa Compact Dry - đĩa môi trường chuẩn bị sẵn. 

2. Phương pháp không nuôi cấy

Các phương pháp xét nghiệm vi sinh thực phẩm không nuôi cấy ra đời nhằm khắc phục thời gian của phương pháp nuôi cấy. Trong đó 2 nhóm phương pháp dựa trên nucleic acid và dựa trên thực khuẩn thể được sử dụng phổ biến hơn hẳn.

a) Phương pháp xét nghiệm nucleic acid 

 - Phổ biến nhất trong nhóm này là phương pháp PCR với ưu điểm của: nhanh - nhạy - đặc hiệu. Kết quả dương tính có thể đến từ cả vi sinh vật sống và xác vi sinh vật. Vì vậy, khi kiểm tra vi sinh thực phẩm bằng kỹ thuật PCR, người ta thường kết hợp sử dụng các thuốc nhuộm tế bào sống, phương pháp này được gọi là "viability PCR" (vPCR). 

 - Trong phương pháp vPCR, đầu tiên tế bào sẽ được nhuộm với ethidium monoazide (EMA) hoặc propidium monoazide (PMA). Các chất như EMA và PMA sẽ bám vào DNA, tuy nhiên chúng không thể xuyên qua lớp màng tế bào nguyên vẹn nên chỉ có thể bám vào DNA của tế bào có lớp màng không còn nguyên vẹn. Khi được chiếu sáng, các đoạn DNA bị bám bởi EMA hoặc PMA sẽ bị tổn thương không thể phục hồi dẫn đến ức chế mạnh mẽ phản ứng PCR. Không chỉ có PCR, cả các kỹ thuật qPCR và LAMP cũng có thể sử dụng EMA hoặc PMA để phân biệt tế bào sống với tế bào chết theo nguyên lý tương tự.
 

Dù vậy, kỹ thuật vPCR chỉ dựa trên tính toàn vẹn của màng tế bào nên phát hiện các tế bào trạng thái tổn thương không hiệu quả (âm tính giả) và lại cho tín hiệu PCR với các tế bào đã bất hoạt (dương tính giả). Hơn nữa, trong một số giai đoạn sinh trưởng thì thành tế bào vi khuẩn cũng bị đục lỗ một cách tự nhiên nên nếu mẫu được lấy ở các giai đoạn này sẽ cho kết quả không chính xác (âm tính giả).

- Phương pháp RT - PCR cũng được đưa vào sử dụng nhằm phát hiện "tế bào sống" thông qua sự hiện diện của RNA thông tin (mRNA), mRNA là bằng chứng cho hoạt động sinh tổng hợp của tế bào. Trong kỹ thuật RT-PCR, mRNA sẽ được phiên mã ngược thành cDNA (giai đoạn RT) rồi sau đó được khuếch đại nhờ phản ứng PCR.

b) Phương pháp dựa trên bacterio phage  

(nguồn Genesmart).
Phage xâm nhiễm trên vi khuẩn một cách cực kỳ đặc hiệu và hiệu quả, đồng thời phage chỉ xâm nhiễm trên vi khuẩn còn sống đo đó giúp phân biệt tế bào sống và xác tế bào dễ dàng. 

Xét nghiệm vết tan (plaque assay): là phương pháp xét nghiệm đơn giản dựa trên khả năng ly giải tế bào vi khuẩn của phage. Trong phương pháp này mẫu sẽ được ủ với phage, các phage ngoại bào bị tiêu diệt. Ngay trước thời điểm bùng phát, mẫu sẽ được pha loãng ở nồng độ thích hợp và nuôi cấy trải trên đĩa thạch mềm cùng với vi khuẩn chỉ thị. Vi khuẩn chỉ thị có thể là bất kỳ vi khuẩn nào, miễn là chúng sinh trưởng nhanh và có khả năng nhiễm loại phage đang sử dụng.

Đến thời điểm bùng phát, phage sẽ thoát khỏi tế bào trong mẫu và nhiễm vào các tế bào vi khuẩn chỉ thị xung quanh và sau khoảng 1 ngày ủ thì trên đĩa thạch sẽ xuất hiện những vết tan (plaque). Mỗi một vết tan được gọi là 1 PFU, chỉ số PFU/mL mẫu đại diện cho nồng độ vi khuẩn trong mẫu ban đầu.

Nhược điểm: bước tiêu diệt các phage ngoại bào nếu không xử lý tốt sẽ dẫn đến tình trạng dương tính giả.

Xét nghiệm bằng qPCR/miễn dịch: là phương pháp xét nghiệm phát hiện những phage mới được tạo ra sau khi xâm nhiễm và ly giải khỏi tế bào chủ vi khuẩn.
 

Xét nghiệm bằng enzyme - cơ chất: là phương pháp giúp phát hiện những thành phần nội bào phóng thích ra ngoài môi trường thông qua sự phát quang sinh học từ phản ứng giữa enzyme với cơ chất. Có 3 cách phổ biến để phát hiện sự ly giải tế bào:

- Phát hiện các chị thị nội bào có thể là adenosine-5 triphosphate, ATP, β-galactosidase. 

- Phát hiện sự tăng sinh của phage dựa trên luciferase, protease, alkaline phosphatase.

- Phát hiện sự thay đổi độ dẫn điện của môi trường do các chất điện giải nội bào được phóng thích vào môi trường.
Với Máy đo ATP vi sinh bề mặt, Chỉ thị nội bào là ATP.