Nên chọn dung môi Methanol hay Acetonitrile?

Hình 1  là ví dụ về tỉ lệ dung môi và áp suất dẫn truyền dung môi của hỗn hợp nước/acetonitrile và nước/methanol. Áp suất có xu hướng giảm do độ nhớt của dung môi giảm khi tăng nhiệt độ. Với dung môi nước/acetonitrile và nước/methanol, nhiệt độ hoạt động của cột được đặt giữa 25-40^oC. Kết quả cho thấy áp suất gây ra bởi methanol là cao hơn. Do đó, khi đổi dung môi pha động từ acetonitrile thành methanol, cần kiểm tra lại áp suất lúc này của cột và thiết bị. 

Độ hấp thu của dung môi acetonitrile dùng trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và methanol (thuốc thử) được so sánh trong hình 2. Độ hấp thu của dung môi pha động càng nhỏ thì nhiễu gây ra trên đầu dò UV càng thấp. Do đó, acetonitrile dùng trong HPLC là phù hợp với các chất phân tích có độ nhạy cao với bước sóng UV ngắn. Trong đường nền gradient nồng độ dùng đầu dò UV, acetonitrile dùng trong HPLC ít bị xuất hiện “ghost” peak. Dù nhiều dung môi hữu cơ khác có độ tương thích cao hơn với nước, số ít trong chúng cho độ hấp thu nhỏ hơn khi so với acetonitrile.
 

Bước sóng (nm)	Độ hấp thu
	Methanol (thuốc thử)	Acetonitrile dùng trong HPLC
200	0.7078	0.0235
210	0.4813	0.317
220	0.1959	0.077
225	0.0928	0.051

3. Khả năng rửa giải

Nhìn chung, acetonitrile cho thấy khả năng rửa giải tốt hơn so với methanol. Khi trộn acetonitrile hoặc methanol với nước ở cùng 1 tỷ lệ, khả năng rửa giải của acetonitrile là vượt trội hơn hẳn so với methanol. Đặc biệt khi phối trộn ở tỷ lệ thấp, hỗn hợp của acetonitrile có thể không mất quá nửa thời gian rửa giải so với methanol với hợp chất có cùng thời gian lưu.
Hình 3 cho thấy ví dụ về phân tách các hợp chất pararaben là acid p-hydroxybenzoic, sử dụng cột ODS. Khi trộn acetonitrile và methanol với nước ở cùng 1 tỷ lệ, dung môi pha động acetonitrile cho thời gian rửa giải ngắn hơn. Thang đo cho thấy độ mạnh của tỉ lệ dung môi methanol/acetonitrile và nước, được dùng trong tính toán thời gian rửa giải khi thay đổi các dung môi. Nếu ta dùng dung môi pha động là acetonitrile thì cần pha nước tỉ lệ 50/50 (v/v). Ngược lại, khi thay đổi thành methanol thì tỉ lệ methanol/nước phải là 60/40 (v/v).
 

4. Khả năng lưu giữ

Methanol và acetonitrile có tính chất hóa học khác nhau. Methanol là dung môi protic trong khi acetonitrile là dung môi non-protic. Nếu sự phân tách không tốt khi sử dụng dung môi pha động acetonitrile thì việc thay đổi dung môi pha động thành methanol, đồng thời thay đổi thứ tự rửa giải là một cách để phát triển phương pháp phân tích.

Hình 4 là ví dụ phân tách hợp chất vòng benzene với 1 nguyên tử hydro được thay thế bằng nhóm carboxyl hoặc hydroxyl. Dùng dung môi pha động là methanol hoặc acetonitrile. Khi khả năng lưu giữ của ba hợp chất là như nhau. Thứ tự rửa giải phenol và acid benzoic phụ thuộc vào dung môi sử dụng. Tùy thuộc vào loại cột, một số tương tác phụ có thể xảy ra do các nhóm chức phân cực của vật liệu nhồi ngoài các nhóm chức chính biến tính như ODS hay C8 (octyl). Tuy nhiên, không phải lúc nào tương tác phụ cũng mang lại kết quả tiêu cực. 

Hình 5 và 6 cho thấy sự phân tách 13 loại kháng sinh cephem trong cột sắc ký đảo. Lần lượt dùng dung môi methanol và acetonitrile. Ở cùng điều kiện phân tích, thời gian lưu và thứ tự rửa giải là khác nhau giữa acetonitrile và methanol. Như ta đã biết, thứ tự rửa giải sẽ phụ thuộc vào pha tĩnh. Ví dụ, khi so sánh cột ODS và C8, cột C8 sẽ cho khả năng lưu giữ kém hơn. Tuy nhiên, do các nhóm chức phân cực của vật liệu nhồi, không đơn giản khả năng lưu giữ kém hơn mà tương tác lưu giữ cũng khác biệt đáng kể. Do tương tác lưu giữ bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhau, ta cần thử kết hợp giữa các pha động và pha tĩnh khác nhau để tối ưu hóa các điều kiện phân tích.

5. Độ chọn lọc của quá trình rửa giải (phân tách)

Độ chọn lọc của quá trình rửa giải phụ thuộc vào dung môi. Thứ tự rửa giải có thể đảo ngược giữa methanol và acetonitrile. Độ chọn lọc trong quá trình phân tách còn phụ thuộc vào tỉ lệ phối trộn với nước và đặc tính của thành phần hòa tan. Do đó, không phải lúc nào độ chọn lọc của dung môi này cũng cao hơn khi so với dung môi khác.

Ví dụ trong phân tách các đồng phân cấu tạo, cột sắc ký phenyl là phù hợp nhất cho sắc ký lỏng pha đảo. Trong đó, khả năng phân tách sẽ phụ thuộc vào tương tác kỵ nước và tương tác liên kết π – π. Hình 7 là ví dụ phân tách đồng phân cấu tạo của cresol. Acetonitrile (CH₃-C≡N) có nối 3 C-N và 1 electron π, trong đó methanol (CH₃OH) không có electron π. Đối với cột phenyl, khi sử dụng dung môi pha động methanol sẽ thúc đẩy tương tác liên kết π – π và cải thiện khả năng phân tách.

6. Hình dạng peak sắc ký

Peak bị kéo đuôi nhiều hơn khi rửa giải bằng acetonitrile khi so với methanol. Xu hướng kéo đuôi này rõ ràng hơn cả đối với các hợp chất như acid salicylic (phenol với nhóm carboxyl và methoxy nằm ở vị trí ortho). Giải thích cho hiện tượng này là do tính chất hóa học khác nhau của các phân tử dung môi hữu cơ, dung môi pha động tham gia vào tương tác (hấp thu) giữa bề mặt silica và chất phân tích. Tuy nhiên, đối với cột polymer pha đảo, hiện tượng kéo đuôi là ít gặp khi dùng dung môi rửa giải acetonitrile.

7. Độ hòa tan chất phân tích

Methanol cho thấy khả năng hòa tan các hợp chất ion như các hợp chất acid và bazơ cao hơn so với acetonitrile. Với chất phân tích có khả năng hòa tan tốt trong dung môi sẽ giúp dễ dàng giảm thể tích mẫu cần tiêm và điều chỉnh nồng độ giữa dung môi pha động và chất phân tích.

8. Khả năng hòa tan giảm khi trộn với dung dịch đệm

Trong sắc ký pha đảo, đệm chính là muối của dung môi pha động hòa tan trong nước. Tùy thuộc vào loại đệm và dung môi hữu cơ, nếu lượng dung môi quá lớn có thể dẫn đến khả năng hòa tan giảm làm kết tủa muối vô cơ. Bảng 1 và 2 cho thấy khả năng tạo kết tủa của hỗn hợp đệm thường dùng với tỉ lệ acetonitrile và methanol tương tứng. Các giá trị trong bảng cho biết tỉ lệ thể tích (v/v) mà ở đó kết tủa bắt đầu hình thành. Có thể thấy rằng một số dung dịch đệm không tạo tủa với cả 2 loại dung môi hữu cơ, nhưng nhìn chung methanol ít gây ra trường hợp này.

9. Khử khí trong pha động

Để rửa giải đẳng dòng, nước và dung môi hữu cơ sẽ được phối trộn và dự trữ trước khi sử dụng làm dung môi pha động. Khi trộn với nước, methanol cho phản ứng tỏa nhiệt. Lượng khí hòa tan quá bão hòa sẽ nhanh chóng thoát ra khỏi lòng chất lỏng dưới dạng bọt khí (quá trình khử khí). Ngược lại, acetonitrile cho phản ứng thu nhiệt khiến nhiệt độ dung dịch xuống thấp hơn nhiệt độ phòng. Khi hỗn hợp acetonitrile trở lại nhiệt độ phòng, bong bóng khí dần được tạo ra trong lòng chất lỏng. Ngoài ra, khi dùng hỗn hợp này để chạy pha động khi nhiệt độ chưa cân bằng với nhiệt độ phòng, thời gian lưu sẽ giảm và chỉ ổn định khi chất lỏng đạt nhiệt độ phòng. Do đó, nhiệt độ của pha động trong suốt quá trình khử khí cần được xem xét kĩ lưỡng.

10. Hiệu suất ion hóa của LC/ESI-MS

Quá trình ion hóa của ESI là từ giọt mịn trong pha động, do đó dung môi có độ nhớt càng thấp càng thuận lợi cho quá trình này. Khi so sánh, acetonitrile có độ nhớt thấp hơn so với methanol nên cho hiệu suất ion hóa là cao hơn.
Trên đây chúng tôi đã giới thiệu các điểm chính trong việc lựa chọn giữa metanol và axetonitrile làm dung môi hữu cơ trong phân tích HPLC. Từ quan điểm của quy trình phân tích, có sự khác biệt về áp suất cột, độ hấp thụ tia cực tím và khả năng tương thích của đệm,... Và khi nói đến khả năng phân giải trong phân tích, cần chú ý đến hiệu suất rửa giải, độ chọn lọc và khả năng lưu giữ.
Việc hiểu biết về những khác biệt này giữa metanol và axetonitril, cùng với lựa chọn cột thích hợp sẽ giúp cải thiện phương pháp phân tích của bạn. 
Nguồn tham khảo: https://labchem-wako.fujifilm.com/asia/wako-blog/032966.html
https://www.shimadzu.com/an/service-support/technical-support/lib/methanol-acetonitrile.html
Xem thêm các bài viết khác 
Hoặc yêu cầu bài viết chuyên sâu về một đề tài / thắc mắc 
Pacificlab hân hạnh đồng hành cùng quý anh chị trong lĩnh vực phân tích / kiểm nghiệm.