Đánh giá xét nghiệm A3 - tổng adenylate (ATP + ADP + AMP) bằng Lucipac A3

Đánh giá hiệu quả các phương pháp vệ sinh bề mặt là bước đầu tiên trong việc phòng ngừa các bệnh nhiễm trùng trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe. Các xét nghiệm ATP được sử dụng rộng rãi để đánh giá hiệu quả của các quy trình làm sạch. Xét nghiệm này dễ sử dụng và cho kết quả ngay lập tức. Tuy nhiên, ATP có thể bị chuyển hóa và phân hủy thành ADP và AMP. Gần đây, thử nghiệm giám sát tổng adenylate [ATP + ADP + AMP] (gọi tắt là A3) đã được phát triển bởi Kikkoman. Nghiên cứu của M. BAKKE và cộng sự đã sử dụng máy đo ATP LuciPac A3 Surface/Lumitester PD-30 (Kikkoman Biochemifa, Tokyo , Nhật Bản). Kết quả nghiên cứu đã đánh giá tính hữu ích của xét nghiệm A3 trong việc giám sát quá trình vệ sinh bề mặt.

Các bề mặt thường xuyên tiếp xúc, dụng cụ phẫu thuật và ống nội soi bị nhiễm khuẩn là nguyên nhân lây truyền mầm bệnh trong các cơ sở chăm sóc sức khỏe. Làm sạch, khử trùng và sát trùng các bề mặt, dụng cụ và bàn tay là các bước cơ bản để giảm khả năng lây nhiễm và nhiễm trùng. Làm sạch kỹ lưỡng là điều kiện tiên quyết để khử trùng/sát trùng hiệu quả. Theo hướng dẫn khử trùng và sát trùng trong các cơ sở y tế của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh (CDC) của Hoa Kỳ, các chất hữu cơ còn sót lại trên bề mặt có thể gây trở ngại cho quá trình khử trùng/sát trùng, một số chất hữu cơ có thể cản trở hoạt động kháng khuẩn của chất khử khuẩn. Sự can thiệp này xảy ra do các phản ứng hóa học có thể xảy ra giữa chất diệt khuẩn và chất hữu cơ, dẫn đến làm giảm hoạt tính diệt khuẩn. Ngoài ra, vật liệu hữu cơ có thể như một rào cản vật lý bảo vệ vi sinh vật khỏi chất diệt khuẩn. Do đó, các phương pháp đánh giá về mức độ sạch và các phương pháp làm sạch nhanh chóng và dễ dàng đang được yêu cầu sử dụng trong các cơ sở chăm sóc sức khỏe.
 

Theo phương pháp truyền thống, kiểm tra bằng mắt thường để đánh giá mức độ sạch của bề mặt, phương pháp này phụ thuộc thị lực của người kiểm tra. Hơn nữa, một số cấu trúc cụ thể, chẳng hạn như bề mặt bên trong của ống nội soi rất khó kiểm tra. Đo số lượng vi khuẩn sống (VBC) bằng cách sử dụng đĩa thạch nuôi cấy cũng đã được sử dụng. Tuy nhiên, phương pháp này phải mất 24-48 giờ để thu được kết quả. Xác định độ nhiễm bẩn qua protein còn sót lại cũng là một phương pháp được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, quy trình đo lường thường phức tạp và tốn kém và không thể có kết quả ngay lập tức. Xét nghiệm PCR có độ nhạy cao, phát hiện cụ thể loại vi khuẩn, nhưng không thể thực hiện thực địa.
Mặc dù Swab test adenosine triphosphate (ATP) không thể xét nghiệm chính xác loại vi khuẩn, nhưng chúng cho phép đánh giá nhanh chóng các quy trình vệ sinh bề mặt để ngăn ngừa các bệnh nhiễm trùng liên quan đến quá trình chăm sóc sức khỏe.

ATP được tìm thấy trong tất cả các sinh vật sống. ATP nội bào chủ yếu được sử dụng để thúc đẩy các quá trình đòi hỏi năng lượng như vận chuyển tích cực, vận động tế bào và sinh tổng hợp. ATP ngoại bào được coi là một phân tử tín hiệu mạnh mẽ. Do đó, ATP là một phân tử đóng nhiều vai trò hơn là nguồn cung cấp năng lượng cho cả sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân thực. Sự hiện diện của ATP trên bề mặt cho thấy quá trình làm sạch không đúng cách và sự hiện diện của nhiểm bẩn, bao gồm các mảnh vụn hữu cơ và vi khuẩn. Dù sự tồn tại của ATP không phải lúc nào cũng đồng nghĩa là có sự xuất hiện của các tế bào sống. Nhưng mật độ cao của ATP sau quá trình vệ sinh bề  mặt không phù hợp thường cho thấy nguy cơ tồn đọng vi khuẩn cao hơn so với mức ATP thấp. Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh CDC đã liệt kê xét nghiệm ATP là một trong những phương pháp có thể được sử dụng để đánh giá nhanh hiệu quả quá trình vệ sinh bề mặt.
 

Tuy nhiên, các kiểm tra ATP thông thường có một hạn chế là ATP bị phân hủy thành adenosine diphosphate (ADP) và adenosine monophosphate (AMP) bởi nhiệt, axit/kiềm và các enzym. Gần đây, một hệ thống giám sát vệ sinh mới đã được phát tiển để đo tổng hàm lượng adenylate [ATP + ADP + AMP] dựa trên xét nghiệm A3, với sự kết hợp của hai enzym, pyruvate kinase và pyruvate phosphate dikinase, có thể chuyển ADP thành ATP và AMP tương ứng thành ATP. Hệ thống xét nghiệm A3 mới được phát triển cung cấp đồng thời các tín hiệu phát quang sinh học ổn định cho ATP, ADP và AMP. 

Các que tăm bông lấy mẫu và thiết bị thử nghiệm đã chứa thuốc thử và đệm chiết được tích hợp sẵn trong các bộ dụng cụ này. Sau khi lấy que thử ra khỏi ống nghiệm, dùng pipet hút dung dịch mẫu cho lên que thử. Sau đó que thử được đưa trở lại ống phản ứng và đóng nắp lại. Lắc ống nghiệm để trộn kỹ mẫu, dung dịch chiết và thuốc thử. Sau đó lắp ống phản ứng vào máy đo Lumitester .

Thí nghiệm tiến hành tại phòng thí nghiệm thử nghiệm sinh học Nippon, Saitama, Nhật Bản. Mẫu máu hòa tan được chuẩn bị bằng cách pha loãng máu 10 lần với nước không có nuclease và ủ ở 35 °C trong 2 giờ. Các xét nghiệm ATP, ATP + AMP và A3 được thực hiện trong cùng một khoảng thời gian. Các phép đo được lặp lại 5 lần và các giá trị trung bình đã được tính toán. Các tỉ số được biểu thị bằng giá trị tương đối thông qua giá trị RLU.
Các xét nghiệm ATP, ATP + AMP và A3 cho thấy tỷ lệ (ATP + AMP)/ATP và A3/ATP tương ứng là 1.4 và 1.7, và tỷ lệ ATP: ADP: AMP là 1: 0.3: 0.4.
Trong mẫu máu mới hòa tan ATP là chủ yếu. Tiếp theo, sau khi ủ mẫu ở 35 °C trong 2 giờ kết quả đo RLU của ATP, ATP + AMP và A3 lần lượt là: 3882, 34733 và 39314 sau 1 giờ và 226, 33616 và 33996 sau 2 giờ. Tỷ lệ (ATP + AMP) / ATP và A3 / ATP sau 2 giờ là 148.7 và 150.4, và tỷ lệ ATP: ADP: AMP là 1: 1.7: 147.7..
Những kết quả này chứng minh rằng hàm lượng ATP đã giảm xuống dưới 20% sau 1 giờ và gần như hoàn toàn bị phân hủy thành AMP sau 2 giờ. Do đó, xét nghiệm A3 là một công cụ hữu hiệu để đánh giá quy trình làm sạch các dụng cụ phẫu thuật bị dính máu, đặc biêt với các dụng cụ đã qua sử dụng sau 2h. 

Găng tay không có bột và nitrile được đeo trên tay trong 3 giờ. Sau đó, cho 5 ml nước không chứa nuclease vào găng tay và thu hồi lại dung dịch mẫu. Một mẫu trắng cũng được chuẩn bị như đã mô tả ở trên với găng tay chưa sử dụng. Các thử nghiệm ATP, ATP + AMP và A3 được thực hiện với 100 µl mỗi mẫu. RLU mẫu được hiệu chuẩn với RLU của mẫu trắng. Các phép đo được lặp lại 3 lần. Tỷ lệ ATP + AMP và A3 trên ATP cho từng mẫu được tính toán, sau đó thu được giá trị trung bình của chúng.

Các mẫu găng tay thường chứa mồ hôi, tế bào da và vi khuẩn. Giá trị của (ATP + AMP)/ATP và A3/ATP là 8.2 và 20.1. Giá trị tương đối của ADP và AMP cao hơn 11.8 và 7.2 lần so với ATP.  Qua đó có thể thấy ATP là thành phần phụ và ADP là thành phần chính của adenylate trong các mẫu găng tay.
Phương pháp đo A3 có thể đạt được độ nhạy cao hơn 20 và 2.4 lần trong việc phát hiện các mảnh vụn từ tay so với xét nghiệm ATP thông thường và xét nghiệm ATP + AMP tương ứng. Đây cũng là phương pháp hữu ích để đánh giá việc làm sạch môi trường quá trình rửa tay. 

Mức độ sạch của các bề mặt tiếp xúc nhiều trong cơ sở y tế trước và sau khi làm sạch được đánh giá bằng phép đo adenylate và VBC. Sau khi làm sạch, lượng A3 giảm ở tất cả các điểm đo và tỷ lệ suy giảm trung bình là 87%. Ví dụ: giá trị A3 và VBC giảm từ 1280 RLU và 1670 cfu trước khi làm sạch xuống 100 RLU và 0 cfu sau khi lau. Đối với ray giường, 1100 RLU và 50 cfu trước khi làm sạch đã được cải thiện thành 160 RLU và 0 cfu sau khi làm sạch. Giá trị của (ATP + AMP)/ATP và A3/ATP cho tất cả các điểm đo lần lượt là 4.3 và 7.5. Giá trị tương đối của ADP và AMP gấp 3.2 và 3.3 lần của ATP. Các mẫu chứa một lượng lớn vi sinh vật có xu hướng hiển thị giá trị A3 cao. Nếu giá trị RLU chuẩn được đặt ở giá trị điển hình cho các bề mặt tiếp xúc cao (ví dụ: 200 RLU), thì phương pháp đo ATP cho thấy nhiều âm tính giả. Những dữ liệu này chỉ ra rằng độ nhạy của xét nghiệm ATP có thể không đủ để theo dõi vệ sinh của các bề mặt tiếp xúc nhiều trong bệnh viện và xét nghiệm A3 có thể phát hiện tốt hơn. 

 

Các xét nghiệm giám sát vệ sinh ATP được sử dụng rộng rãi trong các cơ sở y tế. Tuy nhiên, nghiên cứu của M. BAKKE đã chứng minh rằng chỉ kiểm tra nồng độ ATP có thể không hiệu quả trong việc kiểm tra quy trình làm sạch đối với các dụng cụ bị nhiễm máu và các bề mặt tiếp xúc nhiều trong các cơ sở y tế. Trong mẫu máu hòa tan, ATP phân hủy nhanh chóng thành AMP thông qua ADP, và AMP được tích lũy. Trong các mẫu găng tay đã sử dụng và trên các bề mặt tiếp xúc nhiều, ATP chỉ chiếm khoảng 5% và 13% tương ứng của A3. Kết quả là, nếu giá trị chuẩn không phù hợp, phương pháp ATP có thể tạo ra kết quả âm tính giả đối với các bề mặt tiếp xúc nhiều. Mặt khác phép đo A3 sẽ cung cấp độ nhạy cao hơn cho tín hiệu dương tính ngay cả trong trường hợp ATP bị suy giảm.

Một nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng sự ức chế bởi các hợp chất khử khuẩn, chẳng hạn như natri hypoclorit (500 ppm nồng độ clo hữu hiệu), etanol (khoảng 80%) và benzalkonium clorua (0,1%) tới quá trình đo A3 khi pha loãng 10% thể tích không đáng kể. Nghiên cứu bổ sung cũng chứng minh rằng sự hiện diện của hydrogen peroxide (3%) và các chất làm sạch có chứa chất tẩy rửa, enzym, ví dụ protease, và các hợp chất ngăn ngừa rỉ sét có ít ảnh hưởng đến các thử nghiệm A3 trong cùng điều kiện.