Có nhiều bạn nghĩ rằng sẽ không có ảnh hưởng đáng kể đến kết quả phân tích bởi tính nhất quán giữa các đĩa trong một thử nghiệm. Bạn sẽ sử dụng ghép các giếng của các hộp kit khác nhau vào chung 1 thử nghiệm hoặc các bạn sẽ tiến hành trộn lô, để tiết kiệm thuốc thử của lô kit trước.
Trên thực tế, bạn không bao giờ nên trộn các thành phần giữa các lô kit. Mỗi lô thử nghiệm (Lot No.) được thiết kế để cung cấp cho bạn với 1 hiệu năng nhất định trong hạn sử dụng. Nếu bạn trộn nhiều lô, bạn có thể vô tình đưa vào thuốc thử có thể đã bị phân huỷ dẫn đến kết quả xét nghiệm kém tối ưu hoặc không hiệu quả.
Cũng có thể đảm bảo tính nhất quán của từng lô giữa các lần chạy thử nghiệm bằng cách: đồng nhất thuốc thử cùng 1 Lot No, cùng 1 điều kiện bảo quản, vận chuyển,… Nhưng chúng tôi khuyến khích các bạn không nên làm điều này.
Về cơ bản, tính nhất quán nên được kiểm soát kĩ bằng việc dán code quản lí hộp kit và các thành phần của kit. Dữ liệu ngày nhập xuất điều kiện bảo quản Kit này nên được ghi nhận đầy đủ. Điều này cũng phù hợp theo ISO 17025 dành cho lĩnh vực kiểm nghiệm. 

Đối với người dùng ELISA test kit, độ tái lặp vô cùng quan trọng, nó cho thấy độ tin cậy của phương pháp. Độ tái lập có thể bị ảnh hưởng bởi việc chuẩn bị sai hoặc không nhất quán đối với thuốc thử hoặc thậm chí cả xử lí mẫu. Cần đảm bảo rằng tất cả các thuốc thử của bộ kit được đặt ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30 phút trước mỗi lần xét nghiệm.
 
Nhiều thuốc thử chứa các thành phần phụ thuộc vào nhiệt độ chỉ có thể hoạt động và phân tán đều trong dung dịch khi đã ở nhiêt độ phòng. Do đó, sử dụng thuốc thử ở nhiệt độ phòng đảm bảo rằng cho liên kết miễn dịch nhất quán và sự phát triển màu nhất quán từ xét nghiệm này sang xét nghiệm khác. Sự thay đổi nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến hoạt động xét nghiệm và có thể dẫn đến việc dữ liệu của bạn thiếu lặp lại.
Xử lí mẫu cũng rất quan trọng khi nhắc đến độ tái lặp. Ví dụ: việc lấy mẫu cần nhất quán, giảm thiểu số lần rã đông với mẫu thủy sản và tối ưu hóa độ pha loãng mẫu.

Trong điều kiện cho phép, bạn nên tăng độ chính xác bằng cách thực hiện giếng đôi cho tất cả các điểm trong xét nghiệm bao gồm các giếng nền, giếng chuẩn và mẫu. Điều này sẽ cho phép bạn phát hiện ngay lập tức các điểm chuẩn hay mẫu có OD bất thường có thể ảnh hưởng đến giá trị OD trung bình của bạn.
Ví dụ: nếu bạn vô tình gặp vấn đề với pipet khi vô hóa chất, nó chắc chắn sẽ ảnh hưởng đến OD, do đó sẽ ảnh hưởng đến giá trị trung bình được tính toán dẫn đến nội suy không chính xác từ đường chuẩn.

% CV giữa các lần lặp lại mẫu của bạn cho thấy mức độ ổn định và dấu hiệu nhiễm chéo mẫu. Thử nghiệm thành công và chạy tốt khi % CV giữa các giếng lặp ở mức thấp.
Nên sử dụng các đầu pipet mới cho mỗi thêm mẫu/chuẩn/thuốc thử. Ngoài ra, không nên đổ thuốc thử trở lại chai ban đầu vì điều này cũng có thể vô tình gây nhiễm bẩn thuốc thử. Trong quá trình xử lí mẫu, dụng cụ cần được làm sạch hoặc thay mới trong trường hợp cần.

5. Xây dựng các đường cong chuẩn đáng tin cậy

Đối với các đường cong chuẩn (gọi tắt là đường chuẩn) có thể tái lặp được, hãy đảm bảo pha loãng đường cong theo thứ tự của nhà sản xuất đã hướng dẫn. Việc thêm các điểm chuẩn cao hơn hoặc thấp hơn khoảng nồng độ khuyến cáo của nhà sản xuất sẽ không làm tăng độ nhạy và cũng không cho phép phát hiện các nồng độ cao hơn bởi giới hạn về khả năng liên kết của kháng thể gắn trên thành giếng.
Phải xây dựng các đường chuẩn mới cho mỗi thử nghiệm / đĩa. Hầu hết các xét nghiệm ELISA sẽ đề xuất một khoảng thời gian nhất định để sử dụng các đường chuẩn mới chuẩn bị. Điều quan trọng là tuân theo các khuyến cáo của nhà sản xuất.

6. Đảm bảo xử lí mẫu thử nghiệm chính xác khi tiến hành xét nghiệm ELISA

Để phân tích mẫu chính xác nhất, điều rất quan trọng đối với mỗi người dùng là cần tối ưu hóa độ pha loãng bởi mức độ đánh dấu sinh học có thể thay đổi tùy theo khả năng gây nhiễu chất nền. Do đó, điều quan trọng là:

• Nồng độ chất phân tích trong mẫu rơi vào vị trí an toàn trên đường chuẩn (khuyến cáo giữa điểm chuẩn 2 và 4).
• Kiểm tra độ tuyến tính pha loãng bằng cách sử dụng dung dịch pha loãng (sample delution).

Bằng kinh nghiệm cá nhận, bạn vẫn nên tự tối ưu hóa tỷ lệ pha loãng cho các mẫu của mình và tham khảo thêm hướng dẫn/ khuyến nghị cho nền mẫu.  Một số bạn đánh giá thấp tầm quan trọng của quá trình tối ưu hóa này và trong một số trường hợp, kết quả là dữ liệu mẫu không tuyến tính, nằm ngoài đường cong hoặc quá thay đổi khiến dữ liệu về cơ bản không thể sử dụng được.
Ví dụ điển hình, mẫu khi đã nằm ngoài điểm chuẩn 4, bạn pha loãng 10 lần, nếu kết quả giảm 10 lần (đã đạt độ tuyến tính pha loãng) thì kết quả ban đầu chấp nhận. Nếu sau pha loãng, kết quả chỉ giảm 5 lần- 7 lần, bạn cần tiến hành pha loãng thêm, ở ví dụ này có thể là 20 lần, so sánh kết quả giữa pha loãng 10 lần và 20 lần đã đạt tỉ lệ tuyến tính chưa. Nếu đạt, lấy kết quả sau pha loãng 10 lần, nếu chưa đạt cần pha loãng tiếp. … Các quá trình này sẽ được rút ngắn lại bằng kinh nghiệm cá nhận, ước lượng khoảng nồng độ của mẫu sản có,…

7. Hiểu và nắm rõ vai trò của giếng nền (background well), giếng kiểm soát (control well).

Để đảm bảo xét nghiệm ELISA của bạn thành công và cho phép khắc phục sự cố nếu có, bạn nên thực hiện thêm các giếng soát.

• Giếng nền: Kiểm tra nhiễm bẩn của hóa chất, thuốc thử, dụng cụ,… %CV của giếng nền càng thấp càng tốt. Về lí tưởng, cần đạt tới %CV của chuẩn zero.
• Giếng kiểm soát: %Recovery nên ổn định cho từng phương phép. Có 2 loại giếng kiểm soát:

          Giếng kiểm soát đường chuẩn: Thêm vào 1 dung dịch biết trước nồng độ pha cùng nền với chuẩn.
          Giếng kiểm soát quá trình xử lí mẫu, cho 1 lượng chất phân tích biết trước hàm lượng vào mẫu sau đó phân tích song song cùng các mẫu khác và tiến hành kiểm tra độ thu hồi để đánh giá thao tác và phương pháp.

8. Sử dụng chất pha loãng và chất đệm được cung cấp / khuyến nghị

Đệm rửa (độ pH, hàm lượng ion v.v.) đều đóng một vai trò nhất định  trong việc tìm kiếm môi trường thuận lợi thử nghiệm kết quả tốt.
Bạn nên sử dụng các chất pha loãng, đệm rửa được cung cấp theo bộ kit để có kết quả tốt nhất có thể.

9. Tuân theo thời gian, nhiệt độ và điều kiện ủ được khuyến nghị

10. Tối ưu hóa đọc và xử lí dữ liệu

Hãy đọc đĩa ở bước sóng được chỉ ra trong sổ tay xét nghiệm và sử dụng phần mềm phân tích dữ liệu được đề xuất.
Nên đọc kết quả ngay khi vừa thêm dung dịch ngừng phản ứng (stop solution).